定位、定量

三维重组

动态测量

*活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量

*活细胞内H+浓度( pH值)的测量

*自由基的检测电动轿车配件无缝管钨绞丝聊城网络公司激光雕刻机

*药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量

应用:细胞膜电位的测量

荧光漂白恢复(FRAP)的测量

笼锁解笼锁的测量

荧光能量共振转移(FRET)的测量

其他应用

1.标记细胞器荧光探针

(1)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死细胞

碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞

Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞

Hochest 33258 (同上)

DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞

Chromomycin A3 450/470 DNA G-C

AO 500/526 DNA 活细胞

460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死细胞

SYTO 活细胞

(2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性

AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker

Red

(3)高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 ¨细胞器的单克隆抗体

(4)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体

(5)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ,可染活细胞,阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短

JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光

线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光

可标记活细胞线粒体,且为检测线粒体膜电

位最佳探针: Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,

稳定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞

2、定位、定量

免疫荧光标记(单标、双标或三 标)的定位、定量.如:细胞膜受体或抗原的分布,

微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位

细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI

末端原位杂交-fitc + PI

荧光原位杂交: 染色体基因定位

单细胞凝胶电泳

GFP的表达

游离Ca2+ 的分布与定量

定位、定量研究中常用荧光探针

1)Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针,可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等

1)FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512

2)TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569

3)异硫氰基荧光素 494/518

4)PE 藻红蛋白 565/578

5)Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/618

6)cy5 650/690

7)cy3 490/530

(1)细胞膜表面受体

配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)

标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC

(2)细胞表面抗原、胞内某种蛋白

免役荧光标记: 与抗体耦联,

直标: 一抗+荧光探针电动轿车配件无缝管钨绞丝聊城网络公司激光雕刻机

间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针 肌动蛋白 Palloidine+荧光探针

3. GFP 绿色荧光蛋白

GFP的的发现:60年代,Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren),该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光.然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色,后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白电动轿车配件无缝管钨绞丝聊城网络公司激光雕刻机

GFP, 后经研究表明,在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后,水母发光蛋白产生蓝色荧光,GFP在蓝激光的激发下,产生绿色荧光.将外源基因与GFP DNA

相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.

GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察

如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达

GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程

GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程:定位与定量测量应注意的问题

定位:1.可以对图像进行修饰,

2.pinhole 可尽可能的小.

3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像

定量:

1.仪器的各个条件必须一致

2.必须用原始图像进行定量测量

3.Pinhole尽可能的大